自2020年10月上海快靈發(fā)布“非洲豬瘟高敏PCR試劑盒”（下稱高敏試劑盒）以來，其出色的靈敏度、敏感性、特異性及穩(wěn)定性迅速被廣大豬場實驗室認可。隨著熒光PCR相關技術的普及以及用戶群體的增大，部分之前未被重視的問題也逐漸顯露出來。本篇我們探討下各廠家都諱莫如深的一個點——“假陽”問題，以及相應的解決方案。

    "假陽”問題，事實上在熒光PCR領域并不少見，而造成假陽產生的原因也是紛繁復雜：如操作不當污染、環(huán)境氣溶膠污染或者試劑生產過程污染等。本文所要探討的“假陽”，主要指因試劑特異性導致的假陽，換句話說，即文中所提的“假陽”，與操作者、儀器、環(huán)境均無關，只與試劑盒內的試劑有關。那么試劑盒中到底什么與“假陽”相關呢？縱觀商業(yè)化的非瘟病毒PCR檢測試劑盒，其中都會提及一個重要參數——特異性。

    何為特異性呢？在PCR擴增過程中，如果我們要擴增的非洲豬瘟DNA片段在整條DNA鏈上不止出現了一次，或者樣品中混有的其他物種、細胞或病毒的DNA中含有類似的DNA片段，則可能會將其他片段擴增出來，那最后儀器顯示出來的陽性結果就不一定是非瘟病毒DNA造成的，于是陽性結果也就變成了假陽。因此，通俗來說，特異性反應的是試劑盒能擴增出特定DNA片段的性能，特異性越低，則試劑盒擴增其他片段的概率就越大，即“假陽”幾率更大。

    市售的眾多非瘟病毒PCR檢測試劑盒中，絕大多數廠商在宣傳其試劑盒特異性時均會標注＞99%，最低也不會低于98%，快靈的高敏試劑盒也是如此，特異性可達到99.9%，屬實是已經做到了極限，即使PCR技術發(fā)展至今，因為模板DNA的不確定，依然無法保證100%的特異性。也正因此，特異性，也就是假陽的問題是被大家忽視了。

    在服務客戶的過程中，我們發(fā)現很多客戶在進行非瘟病毒檢測遇到極弱樣本或疑似樣本時，對于陽性場，往往遵循的是“寧殺錯，不放過”，而對于陰性場，往往帶來心理的恐慌，需要確認到底是不是陽性。的確，隨著非瘟一波波的襲來，各檢測單位的工作量都史無前例的倍增，再重新來一遍的全面復核，顯然是對人力和成本的巨大考驗。面對這樣的大環(huán)境，快靈人陷入了沉思。

    “我們?yōu)槭裁匆獙帤㈠e？”

    “當真沒有辦法消除假陽么？”

    帶著這樣的問題，我們開始了新的一輪又一輪的嘗試：提升試劑盒的靈敏度、將特異性由99%提升至99.9%……或許，我們可以把眼界放寬，不局限于單純的擴增？

    于是，高敏試劑盒上市半年后，我們在高敏試劑盒基礎之上研發(fā)出其“升級版”——快靈高敏試劑盒（熔解確認版）。

    快靈高敏試劑盒（熔解確認版），其性能參數與高敏試劑盒一致，我們同樣保證其靈敏度、敏感性、穩(wěn)定性、特異性處在行業(yè)頂尖水平，確?？蛻艨梢缘谝粫r間檢測出陽性樣本。包括其操作、擴增階段也與高敏試劑盒別無二致，至此，我們可以把快靈高敏試劑盒（熔解確認版）等同于高敏試劑盒。詳見表1：

    但，重點來了！快靈是怎么做到的？快靈高敏試劑盒（熔解確認版）突破性地使用了一個新的反應程序——熔解曲線。熔解曲線能鑒別不同的DNA片段，依靠的不是Ct.值，而是其特有的熔解峰，即Tm值，即使一個DNA片段中僅相差一個堿基，都能導致Tm值變動。依靠Tm值的判定就可以確認之前擴增陽性的非瘟樣本是否為真的非瘟陽性，以此達到鑒別假陽，消除客戶疑慮的目的。

非瘟新形勢下，除了要求試劑盒更早的檢測出陽性，更需要真正“精準”檢測。快靈高敏試劑盒（熔解確認版）除了超高的靈敏度、特異性，更是“自帶”熔解曲線，讓假陽無處可藏，讓弱陽“站得住腳”，真正做到打消客戶疑慮，真正做到“不殺錯、不放過”。

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